해당화(Rosa rugosa Thunb.) 부위별 열수추출물의 항산화 활성 분석

해당화(Rosa rugosa Thunb.)는 전남대학교 농장 (35°10’25.5”N 126°54’00.3”E)에서 2016년 7월에 채 취하였다. 꽃, 잎, 열매, 과육, 씨로 분리하여 4°C에 서 냉장보관 후 실험에 사용하였다. 열매는 꼭지를 제거한 후 보관하였으며, 과육은 열매를 4등분으로 절단하여 씨를 제거한 후 실험에 사용하였다.

추출 전에 실온에서 각각의 시료 300 g을 증류수 1 ℓ에 침지하여 48시간 동안 유지하였다. 부피가 큰 잎은 150 g/ℓ로 48시간 침지시킨 후 실험에 사용하 였다. 추출은 clevenger-type 장치로 상압에서 냉각수 순환장치를 이용하여 3회 이상 반복하였다. Heating mantle (MS-DM606, mtops, Seoul, Korea)에서 6시간 동안 열을 가한 후 오일을 추출하고 남은 액상을 열 수추출물로 명명하였다. 감압여과기를 이용하여 고 체 시료와 액상산물을 분리하였으며, 분리된 액상은 동결건조 후 실험 전까지 분말 상태로 보관하였으며 물에 희석한 후 분석에 사용하였다.

총 페놀성 화합물(TPC)을 측정하기 위하여 Folin-Denis 법을 사용하였다(Singleton 등, 1999). 각각의 추출물 0.2 mℓ에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 1 mℓ를 혼합한 후 7.5% Na₂CO₃ 0.8 mℓ를 첨가하였다. 실온 에서 차광상태로 2시간 동안 방치한 후 UV-vis spectrophotometer (JP/UV1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀성 화합물 측정을 위해 vanillin을 표준물질로 사용하였다.

총 플라보노이드(TFC) 함량은 Smith 등(2015)의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 0.5 mℓ에 증류 수 3.2 mℓ를 넣고 5% NaNO₃ 0.15 mℓ와 암반응 시 킨 후, 10% AlCl₃ 0.15 mℓ를 혼합하여 6분간 반응 시켰다. 이후 1 M NaOH 1 mℓ를 넣고 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정을 위해 quercetin을 표준물질로 사용하였다. 분석은 3반복하였으 며 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 Brand-Williams 등(1995) 의 방법을 변형하여 측정하였다. Ethanol에 희석된 추출물 0.1 mℓ와 0.4 mM DPPH 용액 1 mℓ를 혼합 한 후 ethanol 1.4 mℓ를 첨가하여 최종부피를 2.5 mℓ로 조절하였다. 혼합물은 실온에서 차광상태로 30분간 반응시킨 다음 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대 조군으로는 butylated hydroxytoluene (BHT)을 사용 하였다. DPPH 라디칼 소거능은 식 (1)에 의해 구하 였다.

ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re 등(1999)의 방법 을 일부 변형하여 측정하였다. 14 mM ABTS와 4.9 mM potassium persulfate 용액을 1 : 1 (v/v)로 혼합하 여 12~16시간 동안 차광상태로 방치시켜 ABTS⁺를 형성시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.7~0.8이 되 도록 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS⁺용액 0.95 mℓ에 희석된 추출물 0.05 mℓ를 첨가하고 10분 후 흡광도의 변화를 측정하였다. 추출물은 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mℓ로 정량하여 실험에 사용하였다. 양 성 대조군은 BHT를 사용하였고, ABTS 라디칼 소거 능은 식 (1)에 의해 계산하였다. 분석은 3반복 하였 으며 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다.

As : 추출물 첨가군의 흡광도

Ac : 추출물 무 첨가군의 흡광도

추출성분을 확인하기 위해 HPLC (e2695, Waters, MA, USA) 분석을 실시하였다. 당 분석은 Aminex 87H column (300 × 7.8 mm, Bio-Rad, CA, USA)과 Refractive index detector (2414, Waters, MA, USA) 를 사용하였고, 이동상으로는 5 mM 황산을 flow rate 0.6 mℓ/min으로 분석하였다. 유기산은 C18 column (250 × 4.6 mm, Waters, MA, USA)을 이용하였 으며 UV-vis detector (2489, Waters, MA, USA)를 사용하였다. 이동상은 30% methanol (0.1% phosphoric acid, w/w)을 사용하고, Flow rate 1 mℓ/min 으로 분석하였다. 분석용 시료는 0.45 μm filter를 통 과시켜 여과 후 분석하였다. 분석은 3반복 하였으며 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다.

해당화 열수추출물에서 부위별 항산화 활성이 높 았던 추출물(꽃, 잎, 열매)의 항산화 활성 관련 물질 을 확인하기 위하여 open column chromatography를 실시하였다. 추출물에 ethanol을 첨가하여 당을 분리 하였다. 이 과정을 5회 반복하여 당 제거 후 액상시 료는 감압 농축하여 사용하였다. Glass column (26 × 500 mm)에 silica gel 60 (particle size 0.040~0.063 mm, Merck, Darmstadt, Germany)을 충진하였다. 실 험은 Kim 등(2008)의 방법을 변형하여 chloroform과 methanol을 혼합시켜 stepwise 방식으로 전개시켰다. 시간에 따라 용출되는 추출물을 test tube에 10 mℓ씩 수집하였다.

수집된 분획물을 분리하기 위하여 thin layer chromatography (TLC)와 UV-vis spectrophotometer를 사 용하였다. TLC는 silica gel 60 F₂₅₄ plates (Merck, Darmstadt, Germany)를 이용하여 chloroform : acetonitrile : methanol을 1 : 15 : 4 비율로 혼합시킨 용매로 전개시켰다. 흡광도는 190 nm부터 800 nm까지 측정 하였으며, UV spectrophotometer와 TLC plate를 이 용한 각각의 분획물의 Rf 값을 비교하여 구분하였다 (A-F). 분획물의 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 2.2, 2.3항과 동일한 방법으로 측정하였다.

총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 실험은 3반복하였고 실험 결과 의 통계적 유의성 분석을 위해 Pearson 상관분석을 실시하였으며, p-value < 0.05에서 유의한 결과로 판 단하였다. 실험의 통계분석은 IBM SPSS Statistics 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.

페놀성 화합물은 식물이 스스로 보호하고 번식하 기 위한 목적(햇빛, 곤충, 동물 등)으로 생성되는 2차 대사산물로 기본 골격은 aromatic ring 구조에 하이 드록실기(-OH)를 포함하는 것으로 알려져 있다 (Kähkönen 등, 1999; Chen 등, 1996). 페놀성 화합물 의 하이드록실기의 역할은 생체 내의 활성산소를 포 착하여 라디칼을 제거할 수 있으며, 페놀성 화합물 구조와 하이드록실기 위치에 따라 항산화 활성의 차 이가 난다(Rice-Evan 등, 1996). 지금까지 밝혀진 페 놀성 화합물의 효과는 항산화 및 항암작용뿐 아니라 심혈관 질환을 예방하는 등 다양한 생리활성기능을 가지는 것으로 보고되었다(Koo 등, 2016; Valko 등, 2007).

본 실험을 통해 생리활성물질의 유래가 되는 페놀 성 물질을 해당화의 각 부위별 열수추출물에서 확인 하였다(Table 1). 해당화 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 잎 107.29 mg/g, 꽃 102.70 mg/g, 과육 44.20 mg/g, 열매 32.67 mg/g, 씨 21.75 mg/g 순으로 높았 다. 해당화 부위에 따라 총 페놀성 화합물 함량의 차 이는 잎과 씨에서 약 5배로 나타났다.

해당화 잎 추출물 함량은 Kim과 Cha (2017)에 의 한 결과와 유사하며 꽃과 잎 추출물의 총 페놀성 화 합물은 100 mg/g 이상을 함유하고 있었다. 해당화에 존재하는 총 페놀성 화합물 함량은 플라보노이드보 다 부위에 따라서 2.46배에서 6.97배 정도 높게 나타 났다. 또한 Choi 등(2003)이 실험한 국내산 다류인 홍차, 한차, 녹차, 인삼차의 총 페놀성 화합물 함량은 각각 101.51, 95.81, 94.90, 28.30 μg/mg으로 해당화 잎(107.29 mg/g), 꽃(102.70 mg/g) 추출물에서 함량 은 기존 이용되는 차와 비교하여 높게 나타났다. 이 것은 연구된 다류와 비교해서 생리활성 측면에서 해 당화 잎과 꽃 추출물이 더 경쟁력 있는 것으로 판단 된다.

플라보노이드는 C6-C3-C6를 기본골격으로 하는 phytochemical로 식용 및 약용 식물에 다량 함유되어 있으며, 식물체에서 당과 결합하여 배당체 형태로 존 재한다(Urquiaga와 Leighton, 2000). 이러한 특성으 로 플라보노이드는 친수성과 지용성 성질을 모두 포 함할 수 있으며, 폴리페놀 구조에 의해 강력한 라디 칼 소거 활성을 가질 수 있다(Van Acker 등, 1996). 해당화 부위별 열수추출물에서 총 플라보노이드 함 량은 Table 1에 나타냈다.

총 플라보노이드 함량은 꽃 14.74 mg/g, 잎 24.28 mg/g, 열매 13.26 mg/g, 과육 17.96 mg/g, 씨 6.00 mg/g으로 잎 추출물에서 가장 높게 나타났으며 전반 적인 경향은 총 페놀성 화합물 함량과 유사하게 나 타났다. 씨 추출물에서 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량이 상대적으로 낮게 나타났으며, 이것은 시료를 분쇄하지 않고 사용해 비교적 단단한 껍질에 의해 화합물 용출이 용이하지 않은 것으로 판단된다.

해당화 부위별 열수추출물에 대한 HPLC 분석 결 과는 Table 2와 같다. 추출된 당은 glucose, fructose, arabinose, xylose로 모두 환원성을 가지고 있는 환원 당이 검출되었다. 2009년 Xu의 연구에 따르면 정제 된 다당에서 항산화 활성을 확인할 수 있었으며, 당 의 함량이 항산화 활성에 일부 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다(Xu 등, 2009).

유기산을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 신체 내 에서 활성산소를 제거하는데 효과적인 ascorbic acid 는 꽃과 잎 추출물에서만 검출되었다. Ascorbic acid 는 쉽게 산화되기 때문에 고온에서 장시간 열수추출 에 의해 파괴되기 쉽다. 본 실험에서 ascorbic acid는 상대적으로 항산화 활성이 낮은 열매, 과육, 씨 추출 물에서 검출되지 않았다. Citric acid는 꽃 추출물에 서 가장 많이 검출되었다. Citric acid는 감귤류 과일 에 다량 포함되어 있는 물질로 항산화 활성을 증가 시키는 것으로 알려져 있다(De’Nobili 등, 2016). 따 라서 항산화 활성이 가장 높았던 꽃 추출물에서 가 장 많이 발견된 것으로 판단된다. Gallic acid는 주 로 꽃 추출물에서 발견되었으며, 이것은 과일에서 다량 발견되는 phenolic acid로 강력한 항산화 활성 이 있는 것으로 알려져 있다(Aruoma 등, 1993). 또 한 gallic acid는 catechin과 결합하여 강력한 항산 화 작용을 하는 epigallocatechin gallate (EGCG)가 되는 것으로 알려져 있는데, Zhang 등(2014) 연구결 과에 따르면 해당화 차 속에 EGCG가 포함되어 있는 것을 확인할 수 있다. Citric acid, malic acid, gallic acid는 꽃, 잎, 씨, 열매, 과육 추출물 순으로 함유되 어 있었으며, 이는 항산화 활성을 나타내는 DPPH, ABTS 결과와 유사하였다.

DPPH법은 다른 방법과 비교하여 상대적으로 빠 르게 항산화 활성을 평가할 수 있어 가장 널리 이용 되고 있다(Yu와 Oh, 2016). 꽃과 잎 추출물을 비교 했을 때 잎 추출물이 총 페놀과 총 플라보노이드 함 량이 많지만 꽃 추출물의 항산화 활성이 더 높게 나 타났다(Fig. 1). 이것은 추출물에 포함된 유기산이 영 향을 주었을 것으로 사료된다(Kähkönen 등, 1999). 열매와 과육, 씨 추출물을 비교했을 때 DPPH에서는 항산화 활성의 차이가 거의 없었으며 ABTS에서는 열매 추출물에서 다소 높은 결과를 나타냈다.

Fig. 1. DPPH and ABTS radical scavenging activities of hot water extracts from different parts of rugosa rose, a: DPPH radical scavenging activity (%), b: ABTS radical scavenging activity (%).

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DPPH 라디칼 소거능은 Fig. 1(a)에 나타냈다. 해 당화 부위별 열수추출물들의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였다. 꽃 추출물의 경우 4.90~88.55%의 소거능을 보였으며, 잎 추출물은 1.84~85.35%로 꽃과 잎의 추출물이 열매(2.07~19.24%), 과육(2.00~18.22%), 씨(4.05~19.68%) 추출물보다 높은 항산화 활성을 나타냈다. 또한 추출물의 DPPH 라디칼을 50% 억제하기 위해 요구되는 추출물의 농 도 IC₅₀ (Inhibitory Concentration)에 대한 결과는 꽃, 잎, 씨, 열매, 과육 순으로 나타났다(Table 4).

ABTS 라디칼 소거능은 항산화 물질에 의해 강산 화제인 potassium persulfate와 ABTS의 반응으로 생 성된 양이온 라디칼이 제거되는 정도를 측정하는 방 법이다(Re 등, 1999). 이 방법은 다양한 pH에서 측정 할 수 있을 뿐만 아니라 비교적 간단하고 감도가 좋 으며 수용성 및 지용성 관련 모든 항산화 물질에 적 용이 가능한 것으로 알려졌다(Yu와 Oh, 2016).

ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 1(b)와 같다. 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적 으로 증가하였다. 열매와 과육 추출물의 경우 DPPH 와 마찬가지로 낮은 항산화 활성을 나타냈다. 꽃에서 IC₅₀ 농도가 0.27 mg/mℓ로 가장 높은 활성을 확인하 였다.

해당화 부위별 추출물에 포함된 유효물질인 총 페 놀성 화합물, 총 플라보노이드 함량과 항산화 활성을 나타내는 DPPH, ABTS의 연관성은 Table 5와 같다. 모든 요인들은 양의 값으로 선형성을 나타내며 0.500~0.958의 상관관계를 확인할 수 있었다. 총 페 놀성 화합물과 총 플라보노이드의 상관성은 p-value < 0.01에서 0.919의 높은 연관성을 나타냈다. 총 페 놀성 화합물에 영향을 받는 항산화 활성은 각각 DPPH 0.895, ABTS 0.545로 양의 선형성을 확인하 였다. 총 플라보노이드에서는 DPPH 0.958, ABTS 0.500의 연관성으로 총 페놀성 화합물과 유사한 결 과를 나타냈다. 하지만 ABTS는 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 결과에서 낮은 유의성을 나타냈다 (Tai 등, 2011). DPPH와 ABTS의 항산화 활성 사이 에서는 p-value < 0.01 수준에서 유의한 값을 나타내 며 0.649로 선형성을 확인하였다.

해당화 부위별 추출물을 이용하여 항산화 물질을 탐색하기 위해 과육과 씨를 포함하고 있는 열매와 꽃, 잎 추출물의 분획을 실시하였다. 과육과 씨는 열 매에서 분리된 시료로 항산화 활성의 경향이 열매와 유사하여 분획을 실시하지 않았다. Fraction group의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH 라디칼 소거 능을 측정하였다(Fig. 2). Chloroform : methanol = 100 : 0의 비극성 용매로 내린 A fraction group에서 는 꽃, 잎, 열매 추출물 모두 낮은 항산화 활성을 보 였다. 그러나 극성인 methanol이 혼합되기 시작한 이 후 용출된 fraction group에서 높은 항산화 활성을 보 였다. 종합하면 꽃의 C, 잎의 B, 열매의 B fraction group에서 가장 높은 항산화 활성을 확인하였다.

Fig. 2. DPPH radical scavenging activities on each fraction after open column analysis of each extracts from different parts of rugosa rose (at 0.5 mg/mℓ).

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가장 높은 항산화 활성을 나타낸 꽃 추출물 fraction에 대한 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함 량을 측정하였다(Table 6). Fraction C에서 각각 3305.43 μg/g, 878.42 μg/g으로 다른 fraction에 비해 높은 함량을 나타냈다. 또한 Pearson 상관분석 결과 0.996의 높은 연관성을 나타냈다(Table 7). 총 페놀 성 화합물과 DPPH radical scavenging activity는 p-value < 0.001에서 0.998의 높은 연관성을 나타냈다.